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测序常见问题分析
       打开峰图文件,依据图形初步判定测序质量,SAP酶纯化后的头峰杂度比较大,至少前50bp序列一般不可信,后续峰形如果还不错,主峰高、噪峰低、未见干扰峰,测序结果应该可信。一个正常的成功反应,能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 —800 Bases)。
       在进行DNA测序时,紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。
       由于DNA结构上的原因,有时会出现反应中途无法进行之情况。如:G/C rich; G/C Cluster;Poly A、 Poly T的连续结构等。此外,另一种情况为反应中途出现的套峰现象,此种情况一般为DNA结构中的重复序列,造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下:

1 测序结果有很多套峰,出现很多N值 
原因分析:
PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。
在序列的起始端出现N值,主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰,是机器无法正确判读出位何值。有时,引物二聚体或者起始端小片段的丢失,也会出现N值。
模版本身含杂合序列,有等位基因。

2
为什么找不到我的PCR引物序列?
用PCR引物作为测序引物,所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的,所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序,得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中,由于通用引物与插入序列有一段距离,就可以测出您的引物序列。

3
测序结果和文献资料不一样,为什么?
原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致。

4
过短的PCR产物为什么不适于直接测序?
首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化;再者,测序的前50bp和后50bp的序列是不好的,所以不适于直接测序。

5:
酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰,酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。

 
     第一个峰,重叠干扰。如果不判读为干扰峰,那就说明样品不纯,如果是基因组DNA,就很好地说明了样品为杂合子,该位点可能存在SNP现象(T/G)。如果判读为干扰峰,我们只需认定样品此处碱基为T为行了。
第二个峰,错位干扰。如果不判读为干扰峰,则说明样本可能比预期多一个碱基(G),如果判读为干扰峰,我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。

6:
为什么用PCR产物或质粒测序时,经常会出现套峰现象?
(1) 下图是pGEM-T载体测序的结果,在83位点处测序结果出现双峰,即模板中含有两个或两个以上的相同载体,但是插入片段不同。 
解决办法:重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是,重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段,并不足以证明模板的单一。


(2)对于PCR产物也同样有模板不单一的情况,如下图所示,
在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰,且在197bp位置有一个高高的A峰,这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
解决方法:对PCR产物切胶纯化,再进行测序。
 
7poly结构的测序结果 

以polyT为例,在polyA/T结构之后往往出现移码现象,而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。
解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly结构处,即可完成模板全长的拼接。
 
8:含有回文结构的模板测序结果


位点94至137是一个回文结构,该结构导致后面的信号衰减,出现错误的判读。
解决方法:使用反向引物对模板进行测序,测到该回文结构处,即可完成模板全长的拼接。
 
9:G/C rich、G/C Cluster。这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失 
A T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后 面的测序结果出现套峰。根据文献记载,原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。
一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结 构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。 
一般来说,PCR片段直接测序时,A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
     原因不明的复杂结构,测序结果出现突然信号减弱或消 失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。
 
 
10:DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办?
如果DNA片段克隆在载体中,可以用载体上两端的引物同时测序,让其中间交叉互补,便可完全测通。如果这样还读不通,可根据已经测出的序列设计测序引物作进一步测序(此称为Primer Walking法),便可完全测通。

11
染料过量引发的测序问题


原因分析:测序后纯化失败,乙醇浓度过高;反应产物丢失,若纯化后DNA沉淀丢失,残留的Big Dye 将导致峰图中泡泡峰的出现;反应失败同样也会引起泡泡峰的出现。
解决方法:正确的测序后纯化操作,使用浓度适当的乙醇,离心转数等;避免乙醇洗涤沉淀时DNA 的丢失,弃除乙醇之前,要再次离心;纯化试剂要保证新鲜度。
 
12你们给我们的报告上注明缺失是什么意思?
 缺失和Two pattern的情况十分相近。区别在于Two pattern的干扰是无规律的干扰,而缺失这种情况是有规律可寻的。
上面一个就是典型的缺失图谱。可以看到从120位置开始出现缺失,大约是缺失了4个碱基。
缺失这种情况发生在PCR片段中比较多,特别是从组织这类混和模板中扩增得到的PCR片段,往往存在很多杂合和缺失。在质粒DNA中这种情况极少出现,但的确也有发生,有些通过重新筛选单克隆可以将这样的情况排除,有些重新挑选单克隆后缺失现象依旧,后一种情况出现的原因还不是十分明确。
   
13移码突变双模板的存在  
上图是我们的一个质粒测序样品,用M13F通用引物进行测序,从图中可以看出,该序列在290bp后序列明显有两套峰存在。造成该现象的原因可能有如下几条:
1. 序列发生缺失突变
2. 插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在
3.PCR产物用T载体进行克隆时,PCR片段可以以两个方向克隆进T载体
4.  所挑克隆不纯
5.两个大小相近的PCR产物同时存在,无法纯化分开
解决的办法:
1. 对于质粒模板,重新挑选克隆,或从另一段进行测序
2. 对于PCR模板,用另一端引物进行测序,或克隆后进行测序
 
  
 
 
 
 
   

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